细胞外基质支架及其在牙髓再生中应用的研究进展

进展 2020-12-26 09:52:39 阅读:

作者:杨宁,陈旭,刘尧,中国医科大学口腔医学院·附属口腔医院儿童口腔科

恒牙萌出至牙根发育完成通常需要2~3年,在此期间龋病、牙外伤、牙齿发育异常等均可引起牙髓感染坏死以及根尖周组织炎症,影响牙根的继续发育,造成牙根薄弱、易折裂及长度发育不足,甚至可导致牙齿过早脱落,严重影响患儿的咀嚼功能、生长发育及心理健康。全牙髓功能性再生和牙根继续发育是年轻恒牙牙髓及根尖周疾病治疗的理想目标。传统的根尖诱导成形术和根尖屏障术仅能够封闭根尖孔,并不能有效延长牙根长度、增加根管壁厚度,其远期根折率高,疗效并不令人满意。

以干细胞为基础的组织工程技术为牙髓再生带来了新的希望,其包括三大要素:干细胞、支架材料和生长因子,其中支架材料在组织再生中发挥至关重要的作用。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是由细胞分泌到细胞外间质中的蛋白质和多糖类大分子物质。通过不同物理、化学或生物学等方法从组织和器官中去除细胞和抗原,可获得天然ECM支架。其具有良好的力学特性、细胞相容性以及生物降解性,有利于细胞黏附,促进细胞生长、增殖及分化,有效降低其免疫原性,避免过敏反应和疾病传播,因此,ECM支架被认为是目前再生医学中一种极具应用前景的新型生物支架。近年来,ECM支架被应用于皮肤、心脏、软骨等多种组织器官的临床前或临床试验,均获得理想效果。本文就ECM支架的制备、特性及其在牙髓再生中应用的研究进展做一综述。

1.ECM支架的制备

ECM支架制备应根据细胞类型、组织密度、厚度及脂质含量等选择最佳的脱细胞方法,保证在去除细胞和抗原成分的同时,尽可能多保留细胞外基质成分及结构,为细胞生长或组织修复提供最佳的仿生环境。ECM支架制备方法主要分为物理方法、化学方法和生物学方法。

1.1 物理方法

利用物理条件,如温度、压力以及电干扰等来调节组织或器官的物理特性,破坏细胞膜和裂解细胞,将细胞从细胞外基质中去除,从而获得ECM支架。冻融法是应用最广泛的物理脱细胞方法,在快速冷冻过程中会在细胞内产生较大的冰晶,破坏细胞膜结构,能有效裂解细胞,且不会造成ECM中蛋白成分明显损失。其他常用的物理脱细胞方法还包括机械震荡法、压力法、电穿孔法等。物理方法是破坏性最小的脱细胞方法,处理后绝大部分ECM成分和结构保持不变,然而单独应用物理脱细胞方法制备ECM支架存在不能完全去净组织中的细胞、细胞碎片及抗原等问题,因此通常与化学或生物学方法联合使用。

1.2 化学方法

化学方法主要通过使用除垢剂、低渗和高渗溶液以及酸碱溶液等破坏细胞结构,以进行脱细胞处理。除垢剂主要包括离子型、非离子型和两性离子型,其能够溶解细胞膜、分离DNA、去除细胞成分,但同时也会部分破坏ECM中蛋白成分。除垢剂对ECM蛋白和DNA的去除程度随暴露于试剂中时间延长而增加,且受到组织类型、供体年龄等因素影响。

低渗溶液主要通过渗透压原理破坏细胞膜而裂解细胞;高渗溶液能够增加细胞核内DNA溶解度,使DNA从蛋白中分离,发挥脱细胞作用,同时有利于清除支架中残留的核酸成分。这类非等渗溶液不会引起ECM结构的明显变化,但不能完全去除DNA残留物。为了获得最佳的脱细胞效果,组织需反复浸入高渗-低渗溶液中。酸碱溶液是用于脱细胞的另一种化学试剂。使用酸性、碱性溶液处理可有效溶解细胞膜和细胞质,去除核酸。但酸碱溶液会引起蛋白质变性,破坏ECM蛋白组分,例如:乙酸损害胶原成分,降低ECM支架的强度和机械性能;碱溶液损害糖胺聚糖,破坏ECM中的生长因子。

1.3 生物学方法

用于脱细胞的生物学方法包括酶类试剂和非酶类试剂。螯合剂是用于脱细胞的主要非酶类生物制剂,如乙二胺四乙酸二钠盐(ethylenediamine-tetraacetic acid,EDTA)和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)。螯合剂通过隔离金属离子从而破坏蛋白与蛋白间的连接,减少细胞间及ECM中蛋白的黏附。单独使用螯合剂脱细胞效果不佳,通常与酶类试剂联合使用。

在脱细胞的酶类试剂中,核酸酶和蛋白酶是应用范围最广的试剂。核酸酶,如脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶,可分别直接作用于DNA和RNA链,水解磷酸二酯键。蛋白酶,如胰蛋白酶,通过水解肽键作用于蛋白质,使细胞间的蛋白质水解,从而导致细胞离散。这些酶虽然具有显著的脱细胞效应,但酶处理可能会破坏弹性蛋白、胶原蛋白、糖胺聚糖和其他细胞外基质的生物活性成分。因此,酶类试剂常与其他脱细胞方法联合使用,为了最大限度地减少对细胞外基质超微结构的破坏,应选择适当的浓度、温度和时间对特定的组织器官进行脱细胞处理。

2.组织器官来源ECM的特性及应用

对组织器官进行脱细胞处理,去除细胞和抗原,既可保留ECM生物活性成分,又可获得具有组织器官复杂结构的三维生物支架材料。组织来源的ECM支架克服了人工支架不能重现细胞所需的生物微环境以及可能引起炎症和宿主排斥反应等缺点,不仅为种子细胞提供足够的机械支持和生长空间,而且作为高度仿生的分子生物平台调控细胞内与细胞间通信,从而影响细胞迁移、增殖和分化等生物学性能,有望再生具备原有器官功能的“再造器官”。

目前,有多种组织器官来源的ECM支架已成功制备,包括心脏、血管、小肠黏膜、肺、气管、皮肤、神经、角膜、食管、肝脏、肾脏、膀胱和骨等,并以不同形式用于组织工程研究,均取得令人满意的再生疗效。其中部分ECM支架已经实现成品化生产,以小肠黏膜来源的ECM支架最具代表性,被用于重建人体多种组织,包括膀胱、肠、尿道、输尿管、膈肌等,均取得良好效果。然而,一些动物实验和临床试验发现,组织来源的ECM支架存在潜在的病原体转移、炎症或抗宿主免疫反应、无法控制降解速率等问题,尚需进一步研究解决。

3.细胞来源ECM的特性及应用

在体外细胞培养时,细胞分泌大量细胞外蛋白及多糖类大分子物质,沉积后形成细胞外基质,对其进行脱细胞处理,可获得细胞来源的ECM支架。细胞来源的ECM支架不仅具有良好的生物相容性及生物降解性,而且可有效避免组织来源ECM支架的病原体转移风险、不良免疫反应以及来源有限等问题。细胞来源的ECM支架可根据再生组织不同,应用细胞自组装技术实现个性化制备,模拟组织发育不同阶段,提供最适宜的仿生微环境来促进干细胞的黏附、增殖和定向分化,同时保持必需的生物弹性、几何形状、生物力学特性和孔隙率等,为ECM支架在再生医学研究提供了新的策略。

早在1978年,Chen等用非离子除垢剂对体外培养的鸡胚成纤维细胞成功进行了脱细胞处理。目前,细胞来源的ECM支架在骨、软骨、神经和心脏等方面的研究均取得一定进展。此外,细胞来源的ECM可修饰非生物材料的表面,例如:医用性钛材料对细胞亲和力低,利用细胞在钛合金表面沉积ECM,然后进行脱细胞处理,得到ECM修饰的钛表面,大大增强了钛合金的生物相容性。然而,细胞来源的ECM支架难以模仿复杂组织、器官的天然结构及形状,因此应用时需考虑细胞来源的ECM与天然组织器官来源的ECM在组成和结构上存在差异的可能性。

4.ECM支架在牙髓再生中的应用

ECM支架在牙髓再生领域的应用研究成为目前的一个新热点。2012年,Traphagen等首次联合使用物理、化学方法成功去除猪牙蕾基质(toothbud matrices,TBS)细胞成分制备ECM,发现牙源性上皮细胞、间充质细胞能够附着于TBS来源的ECM支架上,并促进细胞增殖。进一步将TBS来源的ECM支架与猪牙上皮细胞、人牙髓细胞和人脐静脉内皮细胞重组植入小型猪下颌骨模型,成功形成由成熟牙釉质、牙髓、牙本质、牙周膜和牙根组成的结构不规则的“工程牙齿”。

另有学者比较不同制备方式获得的牙髓组织ECM支架对根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)的影响,发现结构破坏最小的ECM支架对SCAP增殖及分化性能的促进作用最为显著。因猪的牙髓结构与人类相似,猪牙髓组织进行脱细胞处理后,植入裸鼠皮下能够形成类牙髓样组织。将猪牙髓组织来源的ECM支架植入比格犬根管内,8周后组织学观察可见类人牙髓样组织形成,成牙本质相关蛋白牙本质涎磷蛋白和血管标记物CD31表达阳性,提示异种属ECM支架应用于牙髓再生具有可行性。

最近有学者报道,应用人牙髓组织首次成功构建全牙髓组织来源的ECM支架,体外实验表明该支架能为细胞提供适合的微环境,支持牙髓-牙本质复合体的形成。但在临床移植前,需要进一步评估支架细胞的存活和分化情况。目前细胞来源的ECM支架在牙髓再生中的研究鲜有报道。众所周知,血管是牙髓组织的重要组成部分,也是牙髓再生的关键因素,有学者构建了牙髓干细胞和内皮细胞来源的双ECM支架,并发现双ECM支架的细胞黏附能力与单一牙髓细胞来源的ECM支架相似,但更能够促进新生血管的形成,从而促进类牙髓样组织再生。

5.小结及展望

ECM由于去除了细胞和抗原成分,保留了其中的活性成分及结构,并可通过一系列分子信号影响细胞生物学行为及诱导特定表型的表达,有望成为促进牙髓组织再生的新型支架材料。然而目前ECM支架在牙髓再生中的应用尚处于实验研究阶段,有许多机制和技术问题仍亟需阐明和解决。

来源:杨宁,陈旭,刘尧.细胞外基质支架及其在牙髓再生中应用的研究进展[J].中国实用口腔科杂志,2020,13(05):305-308.

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